从pDNA到AAV和mRNA，基因治疗的工艺革新之路（细胞与基因治疗）
进入新世纪以来，现代生物医药不断刷新的里程碑。2012年全球首个AAV基因治疗药物Glybera用于罕见的遗传性代谢缺陷疾病治疗，2017年全球首个细胞治疗药物Kymriah用于急性淋巴细胞白血病的治疗，再到2020年mRNA技术的异军突起用于新冠肺炎的预防。
从DNA到RNA，从病毒到细胞，中心法则不仅打开的是生命的底层密码，更是为人类的疾病预防和治疗提供了新的可能，基因相关治疗成为当前研究最为火热的领域。根据研究机构的预测，基因治疗产品的销售额将将在2024年的136亿美元。而mRNA疗法基于新冠疫苗的巨大成功，2021年全球销售额即超过500亿美元，2030年前随着其它mRNA疗法的快速突破，将稳定维持在230亿美元左右。
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基因相关药物的快速突破离不开基础研究及转化医学的成功，也离不开生产工艺的持续革新突破。AAV工艺从实验室走向工业化历经20年，mRNA的工艺则体现出原材料多工艺繁杂的特点，相关的药物的生产成本仍然居高不下，需要更多的创新工艺的开发。同时值得注意的是，与蛋白类药物不同，基于安全性的考虑，基因药物的杂质控制更为严格，因此对于其纯化工艺提出更高的要求。
以质粒DNA药物为例，其不仅可单独作为一种基因疗法，在AAV腺病毒药物中也是关键的原材料，在mRNA疗法中也是关键的原料模板。经典的质粒DNA生产表达可简单归结为三个步骤：细菌培养物的生长、 细菌的收获和裂解、质粒 DNA 提纯。在纯化阶段，传统的沉淀离心法纯化质粒的过程中要使用大量有机、有毒及易燃易爆化学物质，这对危险防护及危害品管理方面的工作带来的诸多挑战。与此同时，该方法操作周期长，往往会成为限制大规模量产的一大因素。
基于质粒DNA纯化工艺的成本经济效益和可放大性考量，中空纤维TFF过滤、色谱层析等方法，给质粒DNA的纯化增添了更多的选择性。特别是超螺旋（SC）pDNA、与开环（OC）和线性pDNA亚型的分离通常是质粒DNA生产的难点，高效的色谱分离方式将显著提高工艺收率。
这其中，赛多利斯开发的高配基密度的丁基-改良的色谱整体柱，在吸附洗脱（BE）和样品置换纯化法（SDP）两种模式下，均可以有效保证SC pDNA的收率在98%以上。
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在AAV腺相关病毒治疗领域，工业化工艺的逐步在建立，但是和其它药物一样，产品质量同质性、载体纯度和批次一致性是质控的重要方面，除了确保AAV载体的滴度和生物活性以外，最重要的是提高AAV载体的纯度，去除空的衣壳病毒颗粒或者含有全长基因以外DNA的病毒载体颗粒。空壳的存在不仅使有效转导所需AAV的总剂量增加，还会引起针对病毒的不必要的免疫反应。
这其中赛多利斯作为AAV领域最早的纯化供应商，其对完整AAV病毒颗粒的纯化具有突出的优势，以AAV8为例，对亲和纯化后的AAV病毒颗粒，通过线性梯度法，一步法即可将完整AAV病毒颗粒回收率提高至80%以上，有效保证产品纯度。
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小编点评
mRNA治疗领域，高纯度的质粒DNA仍然是其生产的基石，随后通过体外转录(IVT)以及共转录加帽产生RNA模板，下游工艺包括切向流过滤(TFF)、层析以及随后的第二次切向流过滤。由于mRNA药物的转录是在相关酶的作用下体外进行，短终止RNA转录物（或称流产转录/无效合成）和双链(ds)RNA是mRNA纯化工艺中常见的杂质，高纯度的单链(ss)RNA的控制则是mRNA药物免疫原性和有效性的保证。
赛多利斯开发的 PrimaS 采用阴离子交换和氢键结合的独特组合方式，在递增的pH梯度中纯化ssRNA。DNA、蛋白和dsRNA 在 ssRNA 前洗脱，与ssRNA 充分分离。高盐洗涤可在洗脱前去除大部分dsRNA、DNA和蛋白，提高纯化效果。值得一提的是，即使 盐浓度接近饱和浓度的条件下，ssRNA仍然保持结合状态。在高盐洗涤过程中加入螯合剂，可进一步去除污染物，有利于保持pH 梯度，去除相关工艺杂质和聚集体。
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赛多利斯作为生物百年的生物工艺解决方案供应商，2020年底将斯洛文尼的老牌生物色谱开发与制造公司BIA收购，不断扩展在生物大分子的纯化和分析方面优势，特别针对病毒、质粒和mRNA领域，助力多个细胞和基因疗法走向临床及商业化，在质粒DNA和AAV病毒纯化和质量控制方面提出多种解决方案。
特别是2020年mRNA药物快速阶段，基于mRNA分子量大和剪切力不耐受的特点，同时基于mRNA含点的磷酸酯主链和具有氢键能力的输水核苷酸残基，赛多利斯创新开发出阴离子交换和氢键结合的独特组合纯化模式，并提供从DNA的去除，到短终止RNA转录物（或称流产转录/无效合成）和双链(ds)RNA等杂质的去除方面提供了全面的工具包。
在放大方面，需要注意的是，赛多利斯的BIA是CIM（对流相互作用介质）整体色谱柱的领先者，在工艺流速和清洁验证方面具有显著优势，有望助力更多基因治疗及mRNA药物从实验室走向工业化，造福全球病患。
而赛多利斯，更是从今天开始，向大家开放了免费申领试用活动，扫描下方二维码即可申请样品，并获取《CIMmultus系列纯化mRNA技术说明》！
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参考文献：
1. Evolution of the market for mRNA technology.
2. Mobile on-Demand (MOD) mRNA Vaccine Production: A Design and Optimal Location Study.